光學(xué)顯微鏡的主要觀察方法之熒光觀察 - 分析行業(yè)新聞
日期:2023-02-12 16:07 瀏覽次數(shù):100
熒光現(xiàn)象
熒光是指熒光物質(zhì)在特定波長光照射下,幾乎同時發(fā)射出波長更長光的過程(圖1)。當(dāng)特定波長(激發(fā)波長)的光照射一個分子(如熒光團中的分子)時,光子能量被該分子的電子吸收。接著,電子從基態(tài)(S0)躍遷至較高的能級,即激發(fā)態(tài)(S1’)。這個過程稱為激發(fā)①。電子在激發(fā)態(tài)停留10-9–10-8秒,在此過程中電子損失一些能量②。電子離開激發(fā)態(tài)(S1)并回到基態(tài)的過程中③,會釋放出激發(fā)過程中吸收的剩余能量。
熒光分子在激發(fā)態(tài)駐留的時間為熒光壽命,一般為納秒級別,是熒光分子本身固有的特性。利用熒光壽命進行成像的技術(shù)叫熒光壽命成像(Fluorescence Lifetime Imaging,F(xiàn)LIM),可以在熒光強度成像之外,更加深入地進行功能性準(zhǔn)確測量,獲取分子構(gòu)象、分子間相互作用、分子所處微環(huán)境等常規(guī)光學(xué)成像難以獲得的信息。
熒光的另一個重要特性是Stokes位移,即激發(fā) 峰和發(fā)射峰之間的波長差異(圖2)。通常發(fā)射光波長比激發(fā)光波長更長。這是由于熒光物質(zhì)被激發(fā)之后、釋放光子之前,電子經(jīng)過弛豫過程會損耗一部分能量。具有較大Stokes位移的熒光物質(zhì)更易于在熒光顯微鏡下進行觀察。
熒光顯微鏡及熒光濾塊
熒光顯微鏡是利用熒光特性進行觀察、成像的光學(xué)顯微鏡,廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)等各領(lǐng)域。熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點,非常適合進行特定蛋白、細胞器等在組織及細胞中的分布的觀察,共定位和相互作用的研究,離子濃度變化等生命動態(tài)過程的追蹤等等。
細胞中大部分分子不發(fā)熒光,想要觀察它們,必須進行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記的方法非常多,可以直接標(biāo)記(比如使用DAPI標(biāo)記DNA),或利用抗體抗原結(jié)合特性進行免疫染色,也可以用熒光蛋白(如GFP,綠色熒光蛋白)標(biāo)記目標(biāo)蛋白,還可以用可逆結(jié)合的合成染料(如Fura-2)等。
目前熒光顯微鏡已成為各個實驗室及成像平臺的標(biāo)配成像設(shè)備,是我們?nèi)粘嶒灥暮脦褪?。熒光顯微鏡主要分為三大類:正置熒光顯微鏡(適合切片)、倒置熒光顯微鏡(適合活細胞,兼顧切片)、熒光體視鏡(適合較大標(biāo)本,如植物、斑馬魚(成體/胚胎)、青鳉、小鼠/大鼠器官等)。
熒光濾塊是顯微鏡熒光成像的核心部件,由激發(fā)濾片、發(fā)射濾片和二向分光鏡三部分組成,安裝在濾片轉(zhuǎn)輪里,如Leica DMi8配有6位濾片轉(zhuǎn)輪(圖3)。不同的顯微鏡轉(zhuǎn)輪位數(shù)會有區(qū)別,也有些顯微鏡使用濾塊滑板。
濾塊在熒光成像中起著重要作用:激發(fā)濾片選擇激發(fā)光來激發(fā)樣品,阻擋其他波長的光;通過激發(fā)濾片的光經(jīng)過二向分光鏡(其作用是反射激發(fā)光和透射熒光),反射后通過物鏡聚焦,照射到樣品,激發(fā)出對應(yīng)的熒光即發(fā)射光,發(fā)射光被物鏡收集,透過二向分光鏡,到達發(fā)射濾片。如圖4中:激發(fā)波長為450-490nm,二向分光鏡反射短于510nm的光、透過長于510nm的光,發(fā)射光接收范圍為520-560nm。
熒光顯微鏡常用熒光濾塊可分為長通(long pass,簡稱LP)和帶通(band pass,簡稱BP)兩種類型。帶通通常由中心波長和區(qū)間寬度確定,如480/40表示可通過460-500nm的光。長通濾色片如515 LP,表示可以通過波長長于515nm的光(圖5)。
熒光物質(zhì)具有其特征性激發(fā)(吸收)曲線和發(fā)射曲線,激發(fā)峰為理想激發(fā)波長(激發(fā)效率高,從而可以降低激發(fā)光能量,保護細胞和染料),發(fā)射曲線為發(fā)射熒光波長范圍。因此,在實驗中,我們會盡可能選擇與激發(fā)峰接近的波長進行激發(fā),而接收范圍需包括發(fā)射峰。如Alexa Fluor 488的激發(fā)峰為500nm,在熒光顯微鏡中可以選擇480/40的激發(fā)濾片。
濾塊的詳細信息可以在顯微鏡成像軟件里看到。了解染料并找到*匹配樣品的濾塊對于熒光成像有著至關(guān)重要的作用。熒光染料和熒光蛋白的光譜信息一般在說明書中會注明,也可在網(wǎng)上查閱。
濾塊的選擇除考慮熒光探針的激發(fā)、發(fā)射波長,對于多色標(biāo)記樣品還需考慮是否有非特異激發(fā)、是否串色。此外還需考慮所使用的熒光光源,目前常用的熒光光源有汞燈、金屬鹵素?zé)?,以及近年來飛速發(fā)展的LED光源。熒光光源的光譜有連續(xù)的和非連續(xù)的,在不同波段能量也會不同。LED光源因為其相對較窄的光譜帶、更穩(wěn)定的能量輸出、超長的壽命、更安全環(huán)保等諸多優(yōu)點,正逐步成為熒光顯微鏡的主要光源。
除了顯微鏡內(nèi)置的濾塊,還有外置快速轉(zhuǎn)輪(圖7),徠卡的外置快速轉(zhuǎn)輪相鄰位置濾片轉(zhuǎn)換速度為27ms,可實現(xiàn)高速多色實驗,如FRET及Fura2比例鈣成像(圖8)等。
豐富多樣的熒光顯微成像技術(shù)
為了滿足不同的熒光成像需求,除熒光顯微鏡外,還發(fā)展出了各種熒光顯微成像解決方案:
寬場高清成像系統(tǒng),如Leica THUNDER Imager,采用Leica創(chuàng)新的Clearing技術(shù),在成像時高效去除非焦平面干擾信號,呈現(xiàn)清晰圖像,同時兼有高速成像的優(yōu)點;
共聚焦激光掃描顯微鏡,利用針孔排除非焦平面干擾,實現(xiàn)光學(xué)切片,得到高清圖像及三維立體圖像;
突破衍射極限的超高分辨率顯微鏡及納米顯微鏡,可對小于200nm的精細結(jié)構(gòu)進行觀察;
利用多光子激發(fā)原理進行厚組織及活體深層成像的多光子成像系統(tǒng);
具有高時空分辨率的光片成像技術(shù),成像速度快、分辨率高、光毒性低,特別適合進行發(fā)育、活體動態(tài)觀察等研究;
熒光壽命成像(FLIM),不受熒光物質(zhì)濃度、光漂白、激發(fā)光強度等因素的影響,能更加深入地進行功能性準(zhǔn)確測量;
熒光相關(guān)光譜(FCS)及熒光互相關(guān)光譜(***S),測量熒光分子的分子數(shù)、擴散系數(shù),從而分析分子濃度、分子大小、粘性、分子運動、分子結(jié)合/解離、分子的光學(xué)特性等;
全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRF),極高的z軸分辨率,非常適合細胞膜表面的分子結(jié)構(gòu)和動力學(xué)研究。
熒光顯微成像技術(shù)應(yīng)用廣泛,種類豐富,而且新技術(shù)還在不斷涌現(xiàn),大家可以選擇適合的技術(shù)去完成自己的研究。
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